microRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約為19-25nt單鏈RNA，一般參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。作為非編碼RNA（ncRNA），目前大量的研究顯示一些差異表達(dá)miRNA在眾多的疾病中扮演著重要的角色，而了解miRNA差異表達(dá)，熒光定量PCR是最基礎(chǔ)、應(yīng)用最多的檢測(cè)和定量miRNA的方法。

由于miRNA的長(zhǎng)度比較短，因此傳統(tǒng)的熒光定量并不適用，下面介紹的兩種方法的最根本的原理其實(shí)就是延長(zhǎng)miRNA.因此在這里分享了關(guān)于miRNA進(jìn)行qPCR的兩種方法和一些經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：

一、提取細(xì)胞、血清或外泌體RNA

就目前而言，針對(duì)不同樣品TRIZOL法提取RNA是比較通用的提取RNA的試劑，但是也具有相應(yīng)的提取試劑盒（血清RNA提取試劑盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，但有文獻(xiàn)說(shuō)明TRIZOL法可能會(huì)導(dǎo)致miRNA丟失，也可選擇miRNA提取試劑盒。

二、miRNA的qPCR

1.miRNA莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄 + miRNA熒光定量PCR

原理：在逆轉(zhuǎn)錄過程中我們需要設(shè)計(jì)一個(gè)莖環(huán)引物與我們miRNA序列結(jié)合起到延長(zhǎng)miRNA的作用。而莖環(huán)引物是一個(gè)長(zhǎng)度約為45bp且能夠自身環(huán)化的引物。每一個(gè)miRNA都具有自己特異的莖環(huán)引物。這最重要的原因就是設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物中包含一段與miRNA互補(bǔ)序列有關(guān)：莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物 =5’端的莖環(huán)序列+3’端的miRNA的特定互補(bǔ)序列。

①莖環(huán)引物的設(shè)計(jì)：

首先我們?cè)趍iRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到miRNA的成熟序列(5’-3’)，利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T，一般地通用的莖環(huán)引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，紅色部分的序列可形成自身環(huán)化。

另外，針對(duì)特定miRNA設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物：只需要在通用莖環(huán)引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開始數(shù)6-8個(gè)堿基（一般選擇6個(gè)）的反向互補(bǔ)序列加在莖環(huán)通用序列的3’端即可，這樣就得到某個(gè)miRNA的莖環(huán)引物。

以hsa-miR-30b-5p為例，其成熟序列為UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部換成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；則其莖環(huán)引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

②逆轉(zhuǎn)錄（RT）：去除基因組DNA + 逆轉(zhuǎn)錄（可使用miRNA專用的莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒）

1）去基因組DNA（2ul基因組去除試劑）；

2）RNA體積：根據(jù)提取RNA濃度來(lái)定+free-RNase H2O(to 10ul);

3)吹打混勻，42度反應(yīng)2min；

4)逆轉(zhuǎn)錄：1ul莖環(huán)引物（stem-loop）+試劑盒中逆轉(zhuǎn)錄MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般來(lái)說(shuō)，一次逆轉(zhuǎn)錄只能進(jìn)行一個(gè)miRNA的單獨(dú)逆轉(zhuǎn)錄，但是根據(jù)實(shí)際情況而言，我們可以將miRNA+內(nèi)參U6混合在一管中一同逆轉(zhuǎn)成cDNA。

根據(jù)以上試劑盒設(shè)計(jì)的加樣量，我嘗試過一管內(nèi)混合逆轉(zhuǎn)錄內(nèi)參+5個(gè)miRNA，其中主要的變化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加莖環(huán)引物時(shí)，我們可以將所加入的free-RNase H2O（5ul）替換成不同的莖環(huán)引物(5個(gè))，這種方式在特異性的基礎(chǔ)上又比較高效的合成多個(gè)miRNA，雖然節(jié)省試劑，但是也存在弊端，例如我們加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入過多的莖環(huán)引物合成最終的各種miRNA的cDNA產(chǎn)物可能存在濃度過低，混合不勻可能會(huì)影響后續(xù)的熒光定量。

③熒光定量（qPCR）

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，則通用反向引物為：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)熒光定量：10ul體系（20ul體系減半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）

例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差異表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參：

對(duì)照組+處理組：此時(shí)為了減小誤差bar的大小做4個(gè)復(fù)孔，以八聯(lián)管為例：

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們?cè)谌珖?guó)主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)。