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    砷鉬酸比色法

    發(fā)布時(shí)間: 2023-01-16  點(diǎn)擊次數(shù): 846次

    原理

    還原糖是具有羰基(>C=O)的糖,能將其它物質(zhì)還原而其本身被氧化。

    (1) 還原糖在堿性條件及有酒石酸鉀鈉存在下加熱,可以定量地還原二價(jià)銅離子為一價(jià)銅離子,產(chǎn)生磚紅色的氧化亞銅沉淀,其本身被氧化。具體反應(yīng)如下:


    (2)氧化亞銅在酸性條件下,可將鉬酸銨還原,還原型的鉬酸銨再與砷-酸氫二鈉起作用,生成一種藍(lán)色復(fù)合砷鉬藍(lán),其顏色深淺在一定范圍內(nèi)與還原糖的含量(即被還原的Cu2O 量)成正比,用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖與砷鉬酸作用,比色后做標(biāo)準(zhǔn),就可測(cè)得樣品還原糖含量。

    材料與儀器

    植物材料
    銅試劑 砷鉬酸試劑 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖原液
    分光光度計(jì) 具塞刻度試管 水浴鍋 刻度吸管 容量瓶 漏斗 研缽

    步驟

    1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:


    在一系列刻度試管中,分別加入200μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL,再順序加入蒸餾水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5 及1.4 mL,配成濃度分別為0、10、20、30、40、50 及60μg/mL 的系列葡萄糖溶液。每試管加入銅試劑2mL,混勻后沸水浴中加熱10min,立即冷卻,再加入2mL 砷鉬酸試劑,振蕩兩分鐘后稀釋到20mL,用分光光度計(jì)在620nm 波長(zhǎng)下比色,測(cè)其光密度OD620nm(做一式兩份)。以糖濃度微克數(shù)為橫坐標(biāo),光密度OD620nm 為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。


    2.植物樣品中還原糖的提取:


    將樣品洗凈,吸干其表面水分,切碎混勻,稱取1g 放入研缽中,加入約0.5g 石英砂,磨成勻漿,加水將樣品由玻璃漏斗沖入100mL 容量瓶中,加水達(dá)70-80mL,搖勻后置于80℃恒溫水浴上浸提0.5h。


    待上述樣品冷卻后,沉淀蛋白質(zhì),加入5%硫酸鋅5mL,再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL,以沉淀蛋白質(zhì)。振蕩后靜置,至上層出現(xiàn)清液后再加一滴Ba(OH)2,直至無白色沉淀時(shí),向容量瓶加水至刻度。


    3.還原糖含量的測(cè)定:


    過濾上述已定容的樣品液,取5mL 濾液,再定容到100mL(此步視樣品的含糖量而定)。取已稀釋的溶液2mL,與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖顯色法相同:加銅試劑2mL,煮沸10min,加砷鉬酸試劑2mL,振蕩2mL,定容到15ml,620nm 波長(zhǎng)下比色,記下光密度OD620nm(至少重復(fù)兩次)。

    注意事項(xiàng)

    比色皿的外面應(yīng)被擦干凈。

    常見問題

    OD是當(dāng)光經(jīng)過一個(gè)樣本時(shí),部分光會(huì)被吸收。在光譜學(xué),透光率是出射光和入射光強(qiáng)度的比。


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